芽孢杆菌与益生协同剂在体外相互关系研究返回列表
20世纪80年代，何明清教授根据对下痢仔猪与健康仔猪12种肠道菌群比例的结果分析，提出仔猪下痢的原因，主要是肠内菌群失调的新理论，此理论着重强调肠内菌群苹果的重要性，为预防、治疗肠道疾病提出了新颖的解决方法，同时也为研究和应用微生态制剂提出新的理论根据。在此理论指导下，许多研究者已成功研制了有助于保护畜禽肠道微生态平衡和恢复正常菌群的微生态制剂，并在畜牧业生产中应用，取得较好的效果。但益生菌如芽孢杆菌作为一种外来菌群较难定植于胃肠道，另外为避免已定植的外源菌被排除，则必须连续摄入，才能保持益生菌的有效性。为使进入肠道的益生菌加速繁殖，尽快发挥其作用，益生协同剂应运而生，它是指选择性刺激一种或几种细菌在宿主肠道内生长，增进宿主健康而又不被宿主胃肠道消化的物质。随着研究的不断深入，合生元即益生菌和益生协同剂同时并用的制品具有广阔的应用前景。合生元通过促进外源性活菌在肠道中定植，选择性刺激一种或有限几种益生菌在体内的生长和代谢，从而促进宿主健康。近几年，国内外对益生协同剂作了许多的研究，但它们的工作局限于益生协同剂对双歧杆菌和乳酸杆菌的研究，而芽孢杆菌与益生协同剂关系的研究，国内目前开展较少。本研究选用一株生产中常用的益生芽孢杆菌做实验菌株，以探索七种益生协同剂对它们的影响，从中选出作用最明显的益生协同剂，以期与此株益生芽孢杆菌制成合生元，投入生产实践中应用。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 益生芽孢杆菌菌株
1.1.2 益生协同剂：L-天冬氨酸、棉子糖、乳果糖、纤维二糖、蜜二糖、双歧糖（无糖型）、双歧糖，过滤除菌，4℃冰箱保存备用；
1.1.3 培养基：（1）蛋白胨水（蛋白胨10g；氯化钠5 g，加水至1000mL，调PH值至7.0-7.2，121℃杀菌30分钟）；（2）营养琼脂。
1.2 方法
1.2.1 益生菌标准曲线的制备：取一定量的种子液接种与150 mL三角瓶中（内装50 mL蛋白胨水），放入37℃水浴振荡器中90rpm，培养10小时后得原液，取原液按0，20%，50%，60%，80%，100%的比例进行稀释。分别在660nm下比色，用平板记数法记数菌数，算出平均值，按菌数与OD值的关系，两量记录，共重复四次，然后方差分析，算出回归方程（见表1）。
1.1.2 益生协同剂对芽孢杆菌的影响试验
1.2.2.1 乳果糖：取乳果糖母液（68.46% g/L）（经过滤除菌），按0、2.63、1.34、0.68、0.14 g/L（分别设为对照、浓度1、浓度2、浓度3、浓度4）的工作浓度加入蛋白胨水培养基中，充分混合，放入水浴振荡器37℃，90 rpm，12小时。在0小时用平板记数法测菌数，在6、8、10、12小时测OD值（波长为660nm），带入标准曲线方程得相应菌数，用3点法计算Logistic增生曲线，得出K值（即最大生长量）。再选取对数生长期中的任意二点，套入公式G=LN（Nt）-LN（N0）/（Tt-T0）,计算代时（G值）。采用LSD法对K值及G值进行多重比较。
1.2.2.2 其余六种益生协同剂的实验方法同乳果糖，设定不同工作浓度（见下表）。
2、结果
表2.1 标准曲线及曲线方程
将益生协同剂对菌株作用后所测OD值，代入各自方程，算出菌数，整理入表格，利用Logistic方程拟合，推算出K值，再进一步推导出G值。（见下表2.2）
表2.2 七种益生协同剂对芽孢杆菌（K108cfu/mL）值、G(min)值的影响表
采用LSD法对K、G值进行方差分析。结果表明，不同浓度的纤维二糖、双歧糖（无糖型）、双歧糖等益生协同剂时对SA9802菌具有不同程度的影响，且在本实验浓度范围内具有益生协同剂浓度越高效果越明显的趋势。
不同实验浓度的L-天冬氨酸、棉子糖、乳果糖、蜜二糖既不能显著缩短益生芽孢杆菌的代时（P>0.05），也不能显著提高它们的最大生长量（P>0.05）。
3、讨论
3.1 研究表明细菌的生长呈S型曲线，用Logistic曲线方程可以对其的生长进行拟合。因此本实验采用此曲线方程对SA9802菌的生长进行拟合，效果较为理想，并可以推算出在本实验条件下，该菌的最大生长量及代时。Logistic曲线方程为N=K/（1+e(a-b*t)）(其中a，b为两常数；T为时间，N是指在时间t时的生物量；K 是最大生长量，一般K用三点法估计，a，b用最小二乘法估计。为简便起见，本实验共取五点进行观测)。此方程的生物学意义在于：当研究群体的总数（N）达到极限值（K）一半以前是加速生长时期，以后，生长速率逐渐降低，这是减速生长时期，即当t=a/b时是两时期的分界点。因此我们选取靠近t=a/b任意两点，算出它们的N0 值及Nt 值，再代入方程 G=0.693*（LnNt-LnN0）(tt-t0)，即算出代时，实验中，我们选取t=a/b前第1小时和第2小时，来计算代时。
3.2 双歧糖（无糖型）和双歧糖的四种实验浓度能显著地缩短此芽孢杆菌的代时和提高最大生长量，就作用效果来看，浓度4最好，但综合使用效果与效益考虑，低浓度（浓度1）的应用价值最大。双歧糖是异麦芽低聚糖、果糖低聚糖、麦芽低聚糖及阿斯巴糖等三种低聚糖与一种二肽甜味剂组成的混合物；无糖型双歧糖的主要成分是果糖低聚糖、异麦芽低聚糖、阿斯巴糖。此二种糖都为高甜度、低热量，具有对人体肠道中有益双歧杆菌有均衡增殖作用的糖。实验表明双歧糖（无糖型）与双歧糖对此株益生芽孢杆菌的作用无显著差异。但由于双歧糖（无糖型）中含有果糖，此糖可被多种肠道菌所利用，因此，双歧糖的临床意义较双歧糖（无糖型）高。
3.3 实验浓度的L-天冬氨酸、棉子糖、蜜二糖、乳果糖对益生芽孢杆菌的生长均无显著影响，并不表示任何浓度的此四处益生协同剂对此株菌的生长都没有影响，有可能是益生协同剂的浓度过低。