芽孢杆菌定量测定方法的比较研究返回列表
芽孢杆菌是单细胞微生物，个体小，给生物定量带来一定难度。对一般单细胞微生物来说，培养时的对数生长期，细胞的数量与细胞的生物量之间呈现明显的量比关系，因此细胞个体数量在一定程度上反映生物量的大小。细胞的数量可分为总菌数和活菌数两大类。总菌数包括活菌和死菌，反映生物量的大小，并可核定活菌数的测定结果的正确性。活菌数测定结果，一方面反映生物量的大小，另一方面反映微生物的内部结构，所以活菌数的测定常作为微生物定量的重要指标。本研究比较了芽孢杆菌的几种定量测定方法，以便选择一种适合于不同芽孢杆菌活菌数的准确定量方法。
1、 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种：四株芽孢杆菌，菌号分别为O1、T2、T8、E8，由本中心微生态研究室提供。平皿直径9或12cm，L棒自制。
1.1.2 营养肉汤：蛋白胨10g，牛肉膏5 g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.4。
1.1.3 营养琼脂：营养肉汤加1.8%琼脂粉。
1.1.4 稀释液：0.85%生理盐水。
1.2 方法
1.2.1 涂片染色法：首先将待测菌液作10倍递进稀释，用铂金圈取不同稀释度的稀释液接种环均匀涂在直径为1.0cm的载玻片上圆圈内，尔后固定革兰氏染色，在显微镜下计数每个视野的菌数。一般取10个以上视野计数，求出平均值。按以下公式计算细菌总数。
每毫升原菌液含菌数=每视野已知细菌平均数×稀释倍数×A×B
A：重量系数，即每毫升菌液所含的接种环数。
B：面积系数，即直径为1厘米的圆圈内所含的视野数。
1.2.2 倾注平皿法：将待测菌液作10倍递进稀释，取三个稀释度的稀释液各1 mL与融化并冷至45℃左右的营养琼脂一起倾入无菌平皿中摇匀，静置，待凝固后37℃培养24-48小时，每个稀释度作三个重复。通过平皿上长出的菌落数，计算原菌液含菌数，以每平皿上长出的菌落数在30-300之间合格。
每毫升原菌液含活菌数=同一稀释度的菌落平均数×稀释倍数
1.2.3 涂布平皿法：将待测菌液作10倍递进稀释，取三个稀释度的稀释液各0.1 mL和0.5 mL至营养琼脂平皿表面上，用灼烧过的L形棒或三角形玻璃推子推匀。每个稀释度作三个重复。37℃培养18-24小时，计数平皿面上的菌落数，按以下公式计算原菌液含活菌数。以每个平皿上生长的菌落数在30-300间为合格。
每毫升原菌液含活菌数=同一稀释度的菌落平均数×稀释倍数×10
2、结果
2.1 涂片染色法、倾注平皿法和涂布平皿法三种方法对四株芽孢杆菌的测定结果，涂片染色法为10.5×108/mL，偏高；涂布平皿法为9×108/mL，倾注平皿法为7×108/mL，偏低（见表1）。
表1 三种不同培养方法测定结果
2.2 0.1 mL涂布在直径为9厘米平皿和取0.5 mL涂布在直径为12cm平皿，两种不同取量胳测定结果，取0.1 mL稀释后所含活菌数18.3×108，取0.5 mL为17.6×108（见表2）。
表2 涂布平皿法测定不同取量结果
3、讨论
3.1 细菌计数的方法较多，每种方法都各有优点和局限性，只有在综合考虑各影响因素同需要解决的问题之间的关系之后，才能对具体的方法进行评价、选择。本次试验的目的是要寻找一种简便、快速、准确的测定芽孢杆菌活菌数的方法。
3.2 涂片染色法，是用显微镜直接计数，该法在研究工作中很重要，不需要培养，可以快速测定细菌总菌数，在一定程度上反映了活菌数，可节省大量的人力、物力和时间。因此这种方法可用于快速检测细菌数量。但该法不能区分死细胞和活细胞，测得的结果是死细胞和活细胞的总数，不能客观反映样品中活菌的数量，从本次三种方法检测结果，亦知菌数含量偏高，因此不宜作为测定芽孢杆菌活菌数的方法。
3.3 倾注平皿法，是教学、科研和生产中最常用的一种活菌计数方法。但是操作过程中意外的损伤可能导致菌数的减少，如在稀释倾注平皿过程中细菌受到损伤，引起人为的误差；处于融化状态的营养琼脂温度太高时，易受势力影响的繁殖体往往不能存活，造成操作误差；相反，培养基温度偏低，倾注到平皿后不能与菌液充分混匀，使多个细胞堆积在一起，共同形成一个菌落，以致造成实验误差。有的菌株在这种厌氧培养条件下不能生长，如本次试验E8是严格好氧菌，在深层培养基中不能生长。另外，倾注平皿法的操作比较复杂，每次测定均要准备融化的营养培养基，对操作人员的熟练程度要求较高，故在专性需氧芽孢杆菌活菌数测定中受到极大的限制。因此该法也不能作为专性需氧芽孢杆菌活菌数的测定方法。
3.4 涂布平皿法是一中简便快速的测定方法，影响因素较少能准确测定芽孢杆菌活菌数，只要选择稀释度恰当，便可避免多个细胞堆积在一起共同形成一个菌落。另外，操作比较简单，重复性好，可预先备好经无菌检验过的营养平皿待用。需氧菌、兼性厌氧菌均能生长良好。该法既能保持以上两种方法的优点，又克服了两种方法的弱点。因此，选用涂布平皿法测定专性需氧、兼性厌氧芽孢杆菌的活菌数为宜。
3.5 不同样品量的选择，本次试验为取0.1mL与0.5mL分别用涂布平皿法测定结果，取0.1mL菌数含量偏高，可能因为0.1mL样品太少，容易产生误差，而0.5mL样品涂布在直径为12cm的平皿，以测定芽孢杆菌活菌数为宜。