芽孢杆菌在水产养殖中作为水质改良剂和饲料添加剂已有很多报道，具有稳定性好、耐酸碱、耐挤压和耐高温等特点。肠爽™是结合水产动物生理特点，依据“同源筛分”原则，从健康鲤鱼肠道中定向选育出的枯草芽孢杆菌（CGMCC No.3755），配伍3种植物提取物，经代表国际先进水平的发酵工艺-合生发酵开发而成的新型益生菌类肠道调节剂。
本试验旨在探讨肠爽™20对罗非鱼非特异性免疫力的影响，以为生产实际提供科学依据。
　　2、材料和方法
　　2.1　试验饲料
        采用单因素试验设计，试验基础饲料配方见表1，其粗蛋白含量为33.46%，粗脂肪含量为3.97%。以基础饲料配方为对照组，分别在基础饲料配方中添加4mg/kg的黄霉素和500mg/kg的肠爽™20（枯草芽孢杆菌，含菌量为20亿cfu/g，由北京都润科技有限公司提供），形成抗生素组和肠爽™20组。将试验饲料各原料粉碎、过60目筛后按比例称重混合，再添加豆油混均，50℃烘干，用双螺杆制粒机压制成硬颗粒饲料室温保存使用。
　　2.2　试验用鱼与饲养管理
        本试验在湛江某养殖厂进行，试验用鱼初始体重为50.80±0.06g，随机分组放入100L的桶中，每桶15尾，投喂基础饲料，驯化1周待鱼完全适应饲料及环境后，开始分组进入正式实验。实验共设3个处理，每个处理3个重复。养殖期间每天喂料2次，分别为8：00和17：00，每天投喂至饱食。养殖试验共持续60天，养殖期间水温维持在24～28℃，溶氧保持在6.0mg/l以上。
　　2.3　取样
　　2.3.1 血清和头肾细胞悬液制备
        于养殖试验结束前进行取样，取样前，试验鱼饥饿24 h，每桶随机取鱼6尾，用200ppm 的MS-222进行麻醉，尾静脉取血，同时无菌操作取其头肾，血液在室温下凝集4 h（Hardie等，1990）后，在4℃ 3000rpm离心10min，分离血清，于－70℃保存至使用。
　　头肾细胞悬液制备采用Ortuno等（2000）的方法，即将无菌采取的头肾挤压通过100um的金属筛网，再将其小心放入准备好的34%/51%的Percoll溶液中，4℃下400×g进行不连续梯度密度离心30min，分离位于交界处的巨噬细胞带，用sRPMI-1640冲洗液冲洗两次，并调整悬液浓度为2×10⁸/mL，细胞的成活率用0.01%的胎盘兰测定，保证其成活率在95%以上。
　　2.4　试验方法
　　2.4.1　血细胞吞噬活力
        吞噬实验参考Pulsford等（1995）的方法。取已制备的细胞悬液，在用甲醇清洗过的玻片进行涂片，在室温、湿润环境下贴壁2h，未贴壁的细胞用任氏液洗去，然后滴加浓度为1.2X10⁶个/毫升酵母（Sigma）溶液，再在室温、湿润环境下反应1h，用任氏液冲洗，晾干，加甲醇固定，然后用瑞氏染液进行染色。每张玻片随机计数200个细胞，以吞噬了酵母的细胞所占总细胞比例计算吞噬百分数。吞噬百分数=发生吞噬的细胞总数/200
　　2.4.2　血清替代补体活力
        血清替代补体溶血活性的测定参考Yano（1992）的方法。
　　2.4.3　血清溶菌酶活力
        参考Ellis（1990）浊度比色法测定。用磷酸盐缓冲液（0.05M，pH为6.1）配置浓度为0.2mg/mL的微壁溶球菌（Sigma）悬液。取100ul的血清与1900uL的菌悬液进行混合，在25℃下分别测定其于530nm下在30s和270s的吸光度值。活力单位定义为每min吸光值减少0.001所需要的血清量。
　　2.5　数据统计和分析
        试验数据采用SPSS 11.5 for Windows对所得数据进行处理，然后进行单因素方差分析。
　　3、结果
        本试验结果表明，肠爽™20组与抗生素组的吞噬活力和血清替代补体活力均显著高于对照组（p<0.05），但肠爽™20组和抗生素组之间差异不显著（p>0.05）。肠爽™20组与抗生素组血清的溶菌酶活力有比对照组提高的趋势，但各处理间差异不显著（p>0.05）。
　　4、讨论
        鱼类免疫系统由特异性免疫和非特异性免疫共同组成，其中非特异性免疫是构成鱼类防御系统的重要组成部分。鱼类吞噬细胞在抵御微生物感染的各个阶段发挥重要作用。头肾是鱼类重要免疫器官之一，在水生动物上经常把头肾巨噬细胞的吞噬活力作为衡量其非特异性免疫力的重要指标。溶菌酶是一种碱性蛋白，其存在于鱼类血清、粘膜及免疫器官组织中，通过溶解细菌或作为一种调理素而起到抗菌效果，是鱼类非特异性体液免疫的重要组成部分。补体由存在于鱼类体液中的数十种具有酶活性的球蛋白组成，是鱼类抵抗微生物感染的重要成分。在本试验中，肠爽™20表现出良好的提高机体非特异性免疫力的效果，其原因可能是芽孢杆菌作为非特异性免疫因子，通过细菌本身或细胞壁成分激活机体免疫细胞，使其产生促分裂因子，增强细胞活力或作为佐剂发挥作用（Sekine，1985；潘康成，1999）。 Lalloutte（1968）实验证明，用枯草芽抱杆菌提取的细胞糖蛋白免疫小鼠，可以抵抗大肠杆菌的攻击。Berger（1971）认为枯草芽抱杆菌促进机体的非特异性免疫是由于菌体在肠道分解营养物产生一种被称之为“Protodyne“的蛋白，经机体吸收后对机体防御机能刺激的结果。本试验说明，肠爽™20能够显著提高罗非鱼的免疫机能，取代抗生素，具有很好的应用和推广价值。

表1 基础饲料配方

表2 饲料中添加肠爽™20对罗非鱼非特异性免疫力的影响（n=3,平均值±标准误）

同行字母肩标不同者表示差异显著（p<0.05）