近年来，由于养殖环境日益恶化，病毒性、细菌性疾病频繁暴发，严重危害着我国水产养殖业的发展。而抗生素造成的环境污染、在动物体内的药物残留等问题使其使用受到限制。新型绿色饲料添加剂—微生态制剂不仅避免了病原菌耐药性的产生和药物残留，而且在促生长和提高动物免疫力方面效果显著，可望成为抗生素的有效替代品。但是益生菌的使用效果受多种因素的影响，其中最主要的是菌种在饲料加工工艺和储藏过程中的活力保持及在肠道定植状况。枯草芽孢杆菌具有生长速度快、抗逆性好、稳定性强、能有效抑制有害菌生长等特点，其在水产中的应用具有极大的潜力和优势。
        本试验采用的枯草芽孢杆菌菌株来自北京都润科技有限公司，活菌数达2.0×10⁹cfu/g。试验证明，饲料中的该枯草芽孢杆菌经过120℃膨化处理5min后，其总活菌数保持在80％以上。
        牙鲆（Paralichthys olivaceus），俗称牙片、偏口鱼和比目鱼，肉质细嫩，味道鲜美，深受广大消费者喜爱，是海水养殖的重要经济鱼类。
        本试验旨在研究枯草芽孢杆菌对牙鲆生长性能的影响从而为水产绿色饲料添加剂的开发提供科学依据。

　　2、材料和方法
　　2.1　试验饲料
       采用单因素试验设计，基础饲料配方见表1。在基础饲料（粗蛋白48.50%，粗脂肪9.1%）中分别添加0、0.1、0.2%的枯草芽孢杆菌制剂。
        饲料制作参考Lim（1996）方法，将各原料粉碎，过60目筛，称重，混合，添加鱼油和水混匀，挤压制粒，烘干制成含水量约10%的硬颗粒饲料，将这两种颗粒饲料分别密封进塑料袋保存于室温备用。
2.2试验用鱼及驯化
        本试验在山东某商业养殖厂进行，试验鱼选用当年人工繁殖的同一批牙鲆幼鱼，初始体重12.89±0.078 g，将鱼运回养殖厂后用15ppm的土霉素浸泡2h，然后放入300L的大桶中暂养，投喂基础饲料，驯化1周待鱼完全适应饲料及环境后，开始分组进入正式试验。
　　2.3　试验日常管理
        试验共设3个处理，每个处理3个重复。养殖试验在300L的试验桶中进行，牙鲆放养密度为每桶30尾。养殖期间每天喂料2次，分别为8：00和17：00，每天投喂至饱食，投喂后1h收集未吃饲料，烘干，称重。养殖试验共持续56天，养殖期间水温维持在21～24℃，盐度为29～32‰，pH值7.6～8.3，试验全过程不断充气增氧，溶氧不低于7.5mg/L。
　　2.4　采样
        养殖试验结束时，停食24 h，将所有桶的鱼全部捞出，干毛巾擦去鱼体表面水分，称重，计算成活率，增重率，特定生长率，饲料系数和蛋白质效率。同时，每个处理随机取鱼6尾，－20℃冷冻保存，分别测定鱼体常规成分和肠道消化酶活力。
　　2.5　试验方法
　　2.5.1 饲料鱼体常规成分分析及计算方法
        参照AOAC[1995]的方法。饲料、各原料及鱼体的样品均在105℃烘干至恒重，求得干物质含量，然后进行生化测定。粗蛋白采取微量凯氏定氮法，粗脂肪采用索氏抽提法。
        饲料系数(FCR) =投喂饲料总量(g)/鱼体增重量(g)                                                              
        特定生长率（SGR）=100×( LnWt－LnWo)/T
        增重率=（Wt-Wo）/Wo×100%                                                                                           

　　成活率=(Nt-No)/Nt×100%
        蛋白质效率(PER)= 100×体重增重量/（饲料摄取量×蛋白质含量）
        其中Wt（g）、Wo（g）分别为终末和初始均重；Nt、No分别为终末和初始活鱼数量；T为饲养天数。
　　2.5.2 消化酶的分析方法
　　2.5.2.1 粗酶液的制备
        在冰盘中解剖，取出胃和肠（剥除多余的脂肪和结缔组织），用4℃的蒸馏水冲净消化道内容物，用滤纸吸干水分并分别称重，然后剪碎用其质量29倍体积的4℃的蒸馏水进行匀浆，将匀浆液在4℃下离心30min （10000r/min），将上清液即粗酶提取液置4℃冰箱中保存备用。于24h内测定蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性。
　　2.5.2.2 蛋白酶活力的测定
        肠道蛋白酶活性测定采用福林－酚试剂法（杨建雄，2002）。组织蛋白酶单位定义：1克组织蛋白在37℃条件下每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸的酶量为一个蛋白酶活力单位，用U/gprot表示。
　　2.5.2.3 淀粉酶活力的测定
        淀粉酶活性采用南京建成生物工程研究所试剂盒（碘－淀粉比色法）测定。组织淀粉酶单位定义：1mg蛋白中的淀粉酶，在37℃与底物作用30分钟，水解10mg淀粉为一个单位，用U/gprot表示。
　　2.5.2.4 脂肪酶活力的测定
        脂肪酶活力以牛血清蛋白为标准，采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。组织脂肪酶单位定义：在37℃条件下，每克组织蛋白在本反应体系中与底物反应1分钟，每消耗1umol底物为一个酶活力单位，用U/gprot表示。
　　2.5.2.5 粗酶液中蛋白质浓度的测定
        粗酶液中蛋白质浓度测定采用考马斯亮兰染色法（南京建成生物工程研究所试剂盒）。
　　2.6 数据统计和分析
        试验数据采用SPSS 11.5 for Windows对所得数据进行处理，然后进行单因素方差分析。

　　3、结果
　　3.1 生长指标
        增重率、特定生长率、成活率、饲料系数和蛋白质效率见表2。
        由表2可知，饲料中添加不同梯度的枯草芽孢杆菌与对照组相比有促进牙鲆增重率和特定生长率增加的趋势，其增重率分别比对照组提高了6.3%（ T1）、5.8%（T2），但各处理间差异不显著（P>0.05）。各处理间的成活率差异不显著（P>0.05）。
　　添加枯草芽孢杆菌的试验组饲料系数显著低于对照组（P<0.05），但不同梯度芽孢杆菌试验组之间差异不显著。
        添加枯草芽孢杆菌的试验组蛋白质效率显著高于对照组（P<0.05），但不同梯度芽孢杆菌试验组之间差异不显著。
　　3.2 鱼体肠道消化酶活力分析
        由表3可知，添加枯草芽孢杆菌试验组的蛋白酶活力、脂肪酶活力和淀粉酶活力都显著高于对照组（P<0.05）。
　　3.3 鱼体体成分常规分析
        由表4可知，饲料中添加枯草芽孢杆菌和酵母培养物对鱼体水分、蛋白和脂肪均无差异显著性影响（P>0.05）。

　　4、讨论
        饲料中添加枯草芽孢杆菌对牙鲆生长和肠道消化酶活力的影响。枯草芽孢杆菌是以内孢子的形式存在，对干燥、高温、高压、氧化及肠道强酸性等不良环境的抵抗力很强，其在肠道繁殖时分泌大量的蛋白酶及其它酶类能够降解营养物质，有助于宿主对营养物质的吸收利用(Alexander，1977)。在本试验中，和对照组相比，饲料中添加枯草芽孢杆菌有促进牙鲆生长的趋势，并能显著降低饲料系数，提高蛋白质效率，同时，添加枯草芽孢杆菌的试验组显著提高了牙鲆肠道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力，这与杜宣（2006）、Wang等（2006）、刘小刚等（2002）等研究结果相一致。另外，益生菌不仅能够分泌大量的消化酶，还可能合成一些能被宿主利用的营养物质，象VB12 （Sugita等，1991），同时，它还可能提供一些营养物质促进肠道的发育和消化酶的表达，从而促进牙鲆对营养物质的消化吸收（杜宣等，2006；沈锦玉等，2004）。徐海燕（2006）研究表明枯草芽孢杆菌在其生长繁殖过程中既能产生乙酸、丙酸和丁酸等挥发性脂肪酸，这些能够降低动物肠道pH值，从而有效抑制有害菌生长，并为水产肠道有益菌乳酸菌的生长提供酸性条件；又能自身合成VC、VB1、VB2、VB6，为动物提供营养物质，促进其生长，提高生产性能。
　　5、结论
        在本试验条件下，枯草芽孢杆菌能起到显著提高牙鲆肠道消化酶活力，降低饲料系数，提高蛋白质消化率的效果，作为益生菌，其在水产养殖中具有独特的应用优势，是一种较理想的微生态制剂。

表1 基础饲料配方及成分含量分析
Table 1 Basal diet composition and chemical analysis

a复合维生素: 每kg饲料中含有: 维生素B1 110mg；维生素B2 360mg；维生素B6 86mg；生物素 10mg； 泛脂酸钙 507mg； 叶酸 54mg； 维生素B12  0.3mg； 烟酸 1450mg； 维生素K 10mg； 维A醋酸脂 6000IU；维生素D3 1800IU；维生素E 80mg；肌醇 4000mg。
b复合矿物质: 每kg饲料中含有: MgSO4 2.23g； Ca(H2PO4)2H2O 13.47g； KCl 3.02g； KAl(SO4)2 12.7mg；CoCl2 40mg； ZnSO4 7H2O 253mg；CuSO45H2O 7mg； KI 8mg； MnSO4 4H2O 73.2mg； Na2SeO3 2.5mg； 柠檬酸铁 1632mg。

表2 饲料中添加不同水平枯草芽孢杆菌对牙鲆增重率、特定生长率、成活率、饲料系数和蛋白质效率的影响
Table 2  Increased  weight gain(%),specific growth rate,survival(%),FCR and protein efficiency ratio of Japanese flounder fed experimental diets (Mean±S.E, n=3) 

表中数据为平均值±标准误，同一列上不标或标有相同字母表示差异不显著（P>0.05） 
Datas in table are means ± S.E, which in the same line with it or without superscripts have no significant differences determined by Duncan (P>0.05).

表 3 饲料中添加不同水平枯草芽孢杆菌对牙鲆肠道消化酶活力的影响（平均值±标准误）
Table 3 The intestinal digestive enzyme activity of Japanese flounder fed experimental diets (Mean±S.E., n=3) 

表中数据为平均值±标准误(n=3)，同一列上标不同字母表示差异显著（P<0.05）
Datas in table are means±S.E.(n=3), which in the same line with different superscripts have significant differences determined by Duncan (P<0.05).

表4 饲料中添加不同水平枯草芽孢杆菌和酵母培养物对牙鲆体成分的影响
Table 4  The whole body chemical compasition (% dry matter) of Japanese flounder fed experimental diets (Mean±S.E., n=3) 

表中数据为平均值±标准误，同一列上不标或标有相同字母表示差异不显著（P>0.05）
Datas in table are means±S.E., which in the same line with it or without superscripts have no significant differences determined by Duncan (P>0.05).