1、前言
　　病害的频繁发生是阻碍我国水产养殖业发展的重要因素之一，传统抗生素的使用不仅会造成药物残留危害食品安全，而且，大量频繁使用抗生素会污染水质，最终造成水产养殖业的恶性循环，因此，绿色饲料添加剂的开发就成为当前急需解决的问题。益生菌作为抗生素的替代品，近些年来已得到迅速发展，作为水产饲料添加剂则以能耐高温高压的芽孢杆菌为主。肠爽™20是结合水产动物生理特点，依据“同源筛分”原则，从健康鲤鱼肠道中定向选育出的枯草芽孢杆菌（CGMCC No.3755），配伍3种植物提取物，经代表国际先进水平的发酵工艺-合生发酵开发而成的新型益生菌类肠道调节剂。
　　本试验旨在探讨肠爽™20对南美白对虾免疫机能及肠道菌群影响，从而为生产实践提供科学依据。
　　2、材料和方法
　　2.1　试验饲料
　　试验基础配方见表1，在基础配方中，粗蛋白含量为40.8%，粗脂肪含量为7.9%。以基础配方组为对照组，分别在基础配方中添加600g/t肠爽™20（枯草芽孢杆菌，有效活菌含量为20亿cfu/g，由北京都润科技有限公司提供）、100mg/kg黄霉素（有效含量4%），分别形成3种试验饲料。饲料原料均经过60目筛，按配比称重，逐级扩大法混合均匀，然后用双螺杆压条机挤压出直径为2mm的颗粒饲料，经90℃熟化30min后，冷却，保存备用。
　　2.2　试验动物与饲养管理
　　试验虾苗来自于湛江育苗厂同一批孵化的虾苗，挑选规格均一体重约2g左右的健康虾苗于2×2×1.5m的水泥池中暂养2周后进行正式实验。试验分为3个处理，每个处理3个重复，每个重复200尾虾。试验期间每天按虾体重的5-6%投喂，投料4次，分别是6：00、10：30、18：00、22：00，每次投喂比例为30%、20%、30%、20%，根据摄食情况加以调整。饲养期间水温维持在24～28℃，盐度维持在22～29‰，连续充气，养殖期间每3天换水一次，每次换水量为20-30%，每池换水量基本一致。养殖时间30天。
　　2.3　取样
　　养殖试验结束前，将虾饥饿24h，从每池中随机取6尾对虾，用lmL无菌注射器自对虾心脏取血，按1:2的比例和对虾抗凝剂充分混合，进行血细胞计数。另取30尾虾，用lmL无菌注射器心脏采血后，混合置于无菌离心管中4℃静置过夜后，3000r/min离心10min，取上层血清置于-80℃超低温冰箱保存，进行余下免疫指标的测定。 
　　从每个水泥池中随机取10尾虾，无菌操作将虾解剖，去除肠道粪便，置于灭菌的玻璃匀浆器中，加入10mL无菌生理盐水匀浆。再依次以10倍系列稀释，选择合适的稀释度测弧菌及细菌总数。
　　2.4　试验方法
　　酚氧化酶活力测定：参考Hernández-López等（1996）方法略作改动。以实验条件下，每mL血清每min吸光值增加0.001，定义为一个酶活力单位。
　　血细胞总数采用血球计数板进行计数。
　　碱性磷酸酶活力采用南京建成生物有限公司试剂盒测定。
　　细菌总数采取2216E培养基测定，弧菌总数采取TCBS培养基测定。
　　2.5　数据统计和分析
　　试验数据采用SPSS 11.5 for Windows对所得数据进行处理，然后进行单因素方差分析。
　　3、结果
　　从表2可以看出，各处理间血细胞数差异不显著（p>0.05），但肠爽™20组有提高血细胞数的趋势。与对照组相比，肠爽™20组能够显著提高南美白对虾酚氧化酶活力和碱性磷酸酶活力（p<0.05）。表3表明，各处理间细菌总数差异不显著，肠爽™20组和抗生素组均能够显著降低南美白对虾肠道中的弧菌数（p<0.05）。
　　4、讨论
　　4.1　饲料中添加肠爽™20对南美白对虾免疫机能的影响
　　对虾的免疫系统不完善，主要由非特异性免疫力构成。血细胞数、酚氧化酶活力和碱性磷酸酶活力均是衡量虾非特异性免疫力的重要指标。血细胞通过粘附作用、吞噬作用、趋化作用和包裹作用等过程来消除外来异物（Soderhall，1998）。酚氧化酶(phenoloxidase，PO)又称酪氨酸酶，是一种含铜的酶，参与无脊椎动物的防御反应。该系统能被微生物或寄生虫、细胞壁中的β-1,3葡聚糖(βG)、脂多糖(LPS)和肽聚糖(PG)等成分激活，激活后可通过多种方式参与宿主防御反应，包括提高调理素(opsonin )、    促进血细胞吞噬作用、包囊作用和结节形成以及介导凝集和凝固、产生杀菌物质等(李国荣等，2003 )。碱性磷酸酶(ALP)是动物代谢过程中重要的调控酶，它是一种非特异性磷酸水解酶，能催化磷酸单脂的水解及磷酸基团的转移反应，参与机体的各种代谢，它对钙质吸取、骨骼形成、磷酸钙沉积、甲壳素分泌及形成都具有重要的作用(陈清西等，1996 )，可通过免疫制剂的刺激，促使ALP参与对虾细胞中的物质代谢，从而使对虾的非特异性免疫功能增强。在本试验中，肠爽™20组对血细胞数、酚氧化酶活力及碱性磷酸酶活力均有不同程度的提高，说明肠爽™20能够显著提高南美白对虾的非特异性免疫力。这与Gullian等（2004）、Rengpipat等（2000）、王永胜（2006）等研究结果相一致。其原因有可能是芽孢杆菌本身或细胞壁成分刺激非特异性免疫系统使其发挥作用，从而提高动物免疫力。
　　4.2　饲料中添加肠爽™20对南美白对虾肠道菌群的影响
　　水产动物肠道菌群是一个比较复杂的微生态区系，其菌落种类及数量与养殖环境、饲料有着密切关系。从试验结果可以看出，细菌总数对照组最高，其次是肠爽™20组，抗生素组最低。试验进行30d后，抗生素组对虾肠道细菌数量低于有益菌组和对照组数量，表明抗生素对于对虾肠道微生物群落结构的影响比较大，有可能抗生素在杀灭肠道有害菌的同时也抑制了有益菌的生长。而肠爽20不仅能抑制有害菌的生长，保护有益菌的优势地位同时也能够降低有害菌在肠道的数量，因此肠爽™20能够调节南美白对虾肠道微生物群落结构，稳定肠道的微生态环境。试验期间，雨水频繁，对虾本身的微生态平衡被破坏，经常处于应激状态，因此对照组弧菌显著增加，肠爽™20组与抗生素组的弧菌数均显著低于对照组，说明肠爽™20能够抑制弧菌的过度繁殖，抗生素也有抗弧菌生长能力，但长期大量使用抗生素是否会破坏养殖环境并造成弧菌因为产生耐药性而致使数量增加则需要进行长期连续采样进一步研究。
　　5、结果
　　在本试验条件下，饲料中添加合适比例的肠爽™20能够起到提高南美白对虾免疫机能、调节肠道菌群的功效，短时间内，饲料中添加100mg/kg有效含量4%的抗生素黄霉素也能起到刺激免疫力的效果，但其对肠道菌群的影响较大，在杀死有害菌的同时也杀死肠道有益菌。因此，对于长期大量使用抗生素是否会造成动物免疫疲劳和动物肠道菌群紊乱则需要进一步研究。

表1  饲料基础配方

表2  饲料中肠爽™20对南美白对虾免疫机能的影响（n=3,平均值±标准误）

同行字母肩标不同者表示差异显著（p<0.05）

表3  饲料中肠爽™20对南美白对虾肠道菌群（细菌总数和弧菌总数）的影响

同行字母肩标不同者表示差异显著（p<0.05）